Dr Ljiljana Šašić Zorić, naučni saradnik, Institut BioSens

Andrijana Andrić, naučni saradnik, Institut BioSens

Pečurke su zastupljene u ljudskoj ishrani zbog visokog sadržaja proteina, minerala i vitamina. Najčešća kultivisana vrsta pečurke je šampinjon (Agaricus bisporus). Šampinjon se gaji na posebno pripremljenom, delimično kompostiranom organskom supstratu koji ima ulogu medijuma za rast i izvor je hranljivih materija. Micelijum pečurke prorasta kompost razlažući organske materije i tako oslobađa neophodne hranljive sastojke. Pored toga, šampinjon zahteva i sloj treseta koji se naziva pokrivka na površini komposta kako bi se podstakao razvoj plodnih tela i održali stabilni sredinski uslovi u kompostu. Mikrobne zajednice u kompostu i pokrivci imaju značajne uloge u proizvodnji pečurki: (1) predstavljaju važan izvor azota za micelijum pečurke, (2) oslobađaju šećerne rezidue razlažući pšeničnu slamu u kompostiranom supstratu, (3) imaju važnu ulogu u podsticanju razvoja plodnih tela, (4) deluju kao patogeni parazitirajući na micelijumu pečurke. Prema tome, proučavanje diverziteta mikrobnih zajednica je od posebnog značaja za razumevanje i poboljšanje proizvodnje pečuraka.

Zelena plesan, bolest pečuraka uzrokovana patogenim gljivama Trichoderma spp. je najštetnije oboljenje pečuraka. Naziv „zelena plesan“ ukazuje na tamno zelenu boju sporulišućih kolonija. Ovo oboljenje može uzrokovati gubitak prinosa od 60% do 100% i prema tome ozbiljne ekonomske gubitke. Zelena plesan je posebno problematična u organskoj proizvodnji pečurki, jer organska proizvodnja zabranjuje tretman fungicidima. Osnovni problem je kasna detekcija oboljenja u momentu kada je šteta po prinos nepovratna. Sa ovim problemom suočeno je i preduzeće EkoFungi koje su naši istraživači, uključeni u DRAGON projekat imali priliku da posete (više detalja na https://datadragon.eu/rs/2022/01/10/multidisciplinary-approach-combining-metagenomics-molecular-biology-and-hyperspectral-imaging-applied-for-detection-of-fungal-pathogens-on-mushroom-farm/). Prema tome razvoj strategije za ranu detekciju prisustva Trichoderma spp. kao uzročnika zelene plesni je od posebne važnosti i trebalo bi da započne podrobnim ispitivanjem diverziteta zajednica mikroorganizama komposta i pokrivke.

Simultana analiza celokupne zajednice mikroorganizama moguća je korišćenjem metagenomskog pristupa. Metagenomika podrazumeva analizu kolektivnog genoma bioloških zajednica u određenom uzorku iz životne sredine. Omogućava identifikaciju vrsta prisutnih u ovim zajednicama, kao i uvid u metaboličke aktivnosti i funkcionalne uloge mikroorganizama u datom uzorku. Amplikon-zasnovana metagenomska analiza rezultuje velikim podacima o biodiverzitetu koristeći DNK metabarkoding zasnovan na masovnom uzorku. Za DNK metabarkoding gljiva koristi se unutrašnji transkribujući region (ITS) nuklearne ribozomalne DNK kako bi se izvršila taksonomska analiza na nivou zajednica. Koristeći genomsku DNK ekstrahovanu iz uzoraka komposta i pokrivke, kao i odgovarajuće prajmere za amplifikaciju ITS regiona, moguće je proizvesti sekvence neophodne za taksonomsku identifikaciju prisutnih zajednica gljiva, dok višestruko uzorkovanje u različitim vremenskim intervalima daje uvid u promene u diverzitetu zajednica gljiva tokom perioda rasta šampinjona. Na ovaj način moguće je pratiti promene zajednica mikroorganizama kroz vreme, u zavisnosti od razvojne faze, kao i detektovati trenutak kada patogene vrste gljiva kao što su one iz roda Trichoderma počinju da rastu.

Jedan od osnovnih ciljeva DRAGON projekta je unapređenje naučnih i tehnoloških kapaciteta istraživača Instituta BioSens za izvođenje analiza višedimenzionalnih podataka iz različitih izvora, uključujući podatke metagenomike. Zbog toga su naši istraživači sprovodili metagenomske analize na uzorcima koje su sakupili tokom poseta preduzeću “EkoFungi” koje se bavi sertifikovanom organskom proizvodnjom jestivih gljiva u Srbiji, a rezultati su prikazani na tematskoj radionici (više detalja na https://datadragon.eu/rs/2022/01/10/multidisciplinary-approach-combining-metagenomics-molecular-biology-and-hyperspectral-imaging-applied-for-detection-of-fungal-pathogens-on-mushroom-farm/), Podaci o brojnosti i sastavu zajednica gljiva u uzorcima (Slika 1) dobijaju se bioinformatičkom obradom podataka DNK metabarkodinga. Usled velike količine podataka ovaj tip analiza je zahtevan u računarskom smislu i podrazumeva izvesni stepen bioinformatičkog iskustva. Sirove podatke sekvenci trebalo bi prvo spojiti i filtrirati da bi se dobili “čisti podaci” spremni za dalje analize. U narednim koracima se vrši grupisanje sekvenci u operacione taksonomske jedinica (OTU) na osnovu efektivnih podataka. OTU su zatim korišćene u analizi diverziteta i poređenju kompozicije zajednica gljiva između uzoraka. Kao rezultat utvrđen je taksonomski sastav zajednica gljiva u kompostu i pokrivci iz proizvodnje šampinjona, a identifikovano je i osam vrsta Trichoderma među kojima su T. harzianum i T. aggressivum kao najčešći uzročnici zelene plesni.